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技術文章

考馬斯亮藍

                                                                                      

考馬斯亮藍coomassie brilliant blue一定范圍內與蛋白質濃度成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。

考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種。
考馬斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色,*大光吸收在465nm;當它與蛋白質結合后變為青色,蛋白質-色素結合物在595nm波長下有*大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比。考馬斯亮藍R-250與蛋白質反應雖然比較緩慢,但是可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。

染色————————————————————————————————————

蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡,完成反應十分迅速;其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法是1976年Bradford建立,試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質含量,測定蛋白質濃度范圍為0~1 000μg/mL,是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

 

考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種。其中考馬斯亮藍G-250由于與蛋白質的結合反應十分迅速,常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R-250與蛋白質反應雖然比較緩慢,但是可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。

測定含量————————————————————————————————————

簡介

該方法用于大多數蛋白質的定量是比較**的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于細胞骨架的檢驗。

濃染液

將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL 95%乙醇,加入100mL濃磷酸,然后,用蒸餾水補充至200mL,此染液放4℃至少6個月保持穩定。

樣本準備

盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪制標準曲線。

溶解

將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中,該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(*好用PBS)。

稀釋

按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現沉淀,過濾除去。

作用

每個樣本加5mL
稀釋的染料結合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質結合后,將由紅色變為藍色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min.

計算

根據標準曲線計算待測樣本的濃度。

處理方法————————————————————————————————————

 

考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合,反應快速,并且穩定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。