β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法
1.常規(guī)方法
(1).微生物法：
[原理]以一種對(duì)青霉素高度敏感的**-枯草芽孢桿菌作為指示劑，試驗(yàn)時(shí)如果被測(cè)**株產(chǎn)生青霉素酶，破壞了青霉素，則此高度敏感菌株即可生長(zhǎng)，否則，指示劑則被抑制。
[方法]以枯草芽孢桿菌為指示菌，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混于瓊脂平板內(nèi)。然后將被測(cè)菌與產(chǎn)青霉素酶陽(yáng)性及陰性對(duì)照菌株，按下圖接種劃線，在瓊脂培養(yǎng)基中央放置一含青霉素G（1單位）紙片。放置35℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。
[結(jié)果判斷]如被檢菌產(chǎn)生青霉素酶，則沿著被測(cè)菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環(huán)出現(xiàn)凹痕。
(2).碘量法[3]
[原理]β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸，它與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘，破壞了碘和淀粉的蘭色復(fù)合物，使蘭色變?yōu)闊o(wú)色。
[方法]
①將0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml于一小試管中。
②將培養(yǎng)18-24小時(shí)的**在含青霉素試管內(nèi)制成濃厚菌懸液（109/ml）。
③在37℃水浴中放置30分鐘，不時(shí)搖動(dòng)，使酶能破壞青霉素。
④加入1%可溶性淀粉溶液0.5ml，搖勻。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分鐘，觀察結(jié)果。
[結(jié)果]在10分鐘內(nèi)能使蘭色完全消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，不消退者為陰性。
[注意事項(xiàng)]
①由于青霉素很容易分解，因而用于實(shí)驗(yàn)的青霉素應(yīng)新鮮配制。
②淀粉也新鮮配制，在100ml蒸餾水中加入1克可溶性淀粉，放到開(kāi)水中水浴直到淀粉溶解。
③實(shí)驗(yàn)應(yīng)按照步驟操作，如果碘加得過(guò)早，酶反應(yīng)就會(huì)停止，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
④每次試驗(yàn)*好用陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
（3）.紙片酸度定量法[3]
[原理]β-內(nèi)酰胺酶能破壞青霉素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。
[方法]
①將一小片Whatman濾紙放于空平皿中。
②讓濾紙吸足青霉素溶液（0.05M磷酸緩沖液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無(wú)緩沖劑的結(jié)晶青霉素）。
③用接種環(huán)把10-20個(gè)菌落涂到濾紙上，
④蓋好平皿后，將濾紙片在37℃孵育30分鐘，觀察結(jié)果。
[結(jié)果] 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株使濾紙顏色由蘭色變黃色，一般在10分鐘內(nèi)即能看到。
（4）.產(chǎn)色頭胞菌素法[4]
[原理]產(chǎn)色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶所破壞，使其顏色由淺黃色變?yōu)榉奂t色，以此來(lái)測(cè)定**的產(chǎn)酶情況。
[方法]將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置于干凈的平皿內(nèi)，用無(wú)菌的牙簽或接種環(huán)挑取**菌落涂于紙片上，觀察紙片有無(wú)顏色變化。
[結(jié)果]紙片涂抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色，表示該菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，如顏色不變，表示**不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。
檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶方法中，生物學(xué)方法是古老的方法，由于特異性差、靈敏度低，現(xiàn)在基本上很少被采用，頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測(cè)淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）、葡萄球菌，結(jié)果可靠。紙片酸度定量法一般用于檢測(cè)淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。碘量法常用于檢測(cè)淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法。
對(duì)于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶比做藥敏試驗(yàn)?zāi)芨斓氐玫脚R床需要的結(jié)果。β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)還可驗(yàn)證葡萄球菌對(duì)紙片法青霉素的敏感試驗(yàn)結(jié)果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶，因其結(jié)果常常不能預(yù)測(cè)這類(lèi)**對(duì)臨床常用來(lái)**β-內(nèi)酰胺類(lèi)*****的敏感性[5]。